◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇ 回复红旗飘飘网友兼与司先生交流一些看法 天行健 红旗飘飘兄,魏已经采用内皮细胞免疫血清筛选合成的42对多肽,并获得了呈现阳性反 应的你指的多肽1(如果我没弄错,你指的是alpha v integrin-H (330–364)的RAS/V 吧(而不是RGS/V),因为你所指的Y290也在附近,当然,Y290正确编号应为Y320,因 为3-D分子文件少了开头的30个AA),那么,你认为还需要他做一个western blot来证 明他的免疫血清可以与Integrin的线性表位反应吗?肯定反应啊,35个AA的肽段是只能 提供线性表位的,故与肽段反应,必然可以与WB中integrin提供的该肽段线性表位反 应,从而必然能染色integrin条带。所以只要免疫血清与肽段反应阳性,必然也与WB中 的integrin条带反应阳性。魏在文中是没有直接证明,但这个也不需要证明啊,按肽段 反应结果,肯定阳性。况且我也没说魏证明了此事,只是说魏从WB阳性推想至少存在线 性表位是非常合理的,因为WB只提供线性表位,而且魏在文中也没有否认非连续表位的 存在,只是将注意力集中到连续表位上而已(呵呵,谁有简单的方法可以鉴定非连续表 位的细节啊?非连续表位可不是那么好做的)。至于红旗兄认为该肽段只有RAS/V暴露 于分子表面,我也看了一下3D分子模拟图,发现红旗兄指得分子表面是Integrin alpha 和beta的复合物,实际上,RAS/V以及其下游的GDFQTTKLNG全部暴露于Integrin alpha 的分子表面,该表面位于Integrin alpha的2个长条形功能域构成的V字形沟槽中,抗体 与该肽段(RAS(V)GDFQTTKLNG)的结合将严重干扰Integrin alpha正确构象的稳定形成和 与beta的结合。也许红旗兄认为抗体不可能进入该沟槽与Integrin alpha结合,但按照 蛋白质分子是动态振荡于自由能最低的稳态和不稳定的中间态的理论,该沟槽处于一个 不断地打开和合上的动态平衡之中(该分子的2个结构域的铰链也只是由半柔性的Leu构 成,而不是刚性连接的Pro),只是绝大多数时间处于合上的状态而已,抗体完全有机 会与该V字沟槽中的表位结合,结合后将使Integrin alpha的折叠趋向另外一种稳态而 不再按原方式折叠并于beta结合,从而干扰Integrin alpha和beta复合物的形成。 司先生的部分疑问我愿在我所知的范围内与司先生共同探讨,其中若有不对之处请先生 多多指教。据我所知,诱导自身免疫反应,尤其是某些血管相关的自身免疫反应,从而 在动物模型中产生显著的抗肿瘤免疫效果已有多家报道。例如Niethammer等(Nat Med. 2002, 8(12):1369)报道采用编码小鼠自身的VEGFR2基因pcDNA3.1载体转入鼠伤寒沙门 菌作为DNA疫苗,给予小鼠口服3次,结果诱导了小鼠产生针对鼠VEGFR2的CD8+T细胞和 CTL细胞来杀伤VEGFR2阳性细胞,免疫后2周到10个月均具有非常显著的抗肿瘤生长的保 护作用,并且未报告严重的毒副作用,包括肾脏损伤,仅报告了免疫将阻碍伤口愈合。 由于该文作者没有阐述其打破外周T细胞VEGFR2自身抗原免疫耐受的机制,我对他采用 DNA疫苗3次口服免疫就能用完全属于自身的抗原打破耐受并产生强烈的免疫记忆效应 (免疫结束10个月后仍具有极强的保护作用)的机制不是十分清楚,是否是该文采用的 是鼠伤寒沙门菌作为运载VEGFR2表达载体的生物载体的结果?这是DNA疫苗的优势吗? 另外,该文中虽然诱导的T细胞免疫可以显著抑制肿瘤生长以及伤口愈合,但却不杀伤 破坏鼠的正常肾组织,是否是跟小心地控制所诱导自身免疫的强度有关?以上是我想和 先生探讨的一些问题,望先生肯为我解惑。 另外,关于肝功肾功的问题我知道一点,愿提出来供先生参考,一般我们的做法是采用 临床用的自动血生化分析仪测血清中的转氨酶来评价肝功,采用显微镜观察尿中的红细 胞及采用尿液检验诊断试纸测定尿生化指标评价肾功。这是简略的做法,如果要求高, 例如报药,那么血清生化指标要包括天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、血糖(Glu)、总 胆红素(Bil)、肌酐(Cre)、总胆固醇(CHO)等。尿液分析包括尿外观、尿胆素原、隐 血、胆红素、酮体、葡萄糖、蛋白质、pH、亚硝酸盐和尿液沉渣等。魏先生是怎么测的 我也不知道,我在这里仅向先生提供我们的一些常规做法供参考。 还有,关于Western blot中既有21.5kDa小分子蛋白,又有220kDa大分子蛋白的问题, 我查了一下Bio-Rad及法玛西亚这最著名的电泳试剂公司的订货目录,发现他们出售的 10-250kDa的蛋白分子量Marker确实可以在同一块可以跑出来,如果先生有兴趣可以查 一查他们的目录。 看到先生提到代沟的问题,我想我可能上次说话重了,如果因此冒犯了先生还请先生原 谅。 另外提醒先生一点,Scappaticci等(Vaccine, 21:2667-2677)是直接采用活细胞免 疫,其WB的结果自然会大大不同,关于这一点,我也是做过类似实验的,所以知道一 些,也一并提出来供先生参考。但Scappaticci等的实验说明了针对内皮细胞的蛋白组 产生的多抗是可以有效地抗血管治疗肿瘤。倒是Corsini等(Cancer Immunol Immunother (2004) 53: 955–962)采用固定的牛大动脉内皮细胞免疫小鼠,其WB仅1 条带,不知道这与大动脉内皮与静脉内皮蛋白表达谱相去甚远是否有关,但至少说明在 这种免疫条件下,WB可以只有少数几条带。并且,即使Corsini等采用了与肿瘤内皮细 胞蛋白表达谱相差几乎是最远的大动脉内皮细胞,他仍然取得了显著的抑瘤效果。其实 Okaji等(Cancer Sci. 2004 Jan;95(1):85-90)的做法与魏先生的做法有类似之处, 但他们弄了一个比HUVEC更接近肿瘤内皮蛋白表达谱的鼠肝窦内皮细胞(文中所述)来 和HUVEC比,结果自然是他的鼠肝窦内皮细胞疫苗抗转移效果略略好于HUVEC啦。但在 Okaji等的实验中,固定的HUVEC免疫也表现出来了非常强的抗“可视”肺转移灶(可视 的才能进入血管生长期?我看了他的肺转移照片,有很多转移灶直径小于1mm,估计应 该还没有进入血管生长期,应该不计入才对,我认为既然是观察抗血管抗转移的效应, 应该限定转移灶大小至少>1mm直径才合理)形成的能力及抗血管生成的能力。 (XYS20060416) ◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇