◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇ 回复shameman及yan网友,兼我对司魏二位先生之争中各质疑的看法和态度 天行健 前两天看到shameman网友的文章“生命科学是一门实验科学!也说说免疫印迹图片问 题”,本来想写完我对司魏通讯文章的看法(三)再一并回复,但shameman网友既然又 问了我一次,只好先行回复了,待以后再发表看法(三)了。 shameman网友指出俺只对魏等的文章进行“空对空”的理论分析,并不能解决魏先生的 实际问题,建议俺直接去重复实验,然后自然会有人买单。我也非常赞同shameman网友 的观点:生命科学是一门实验科学,一切都应该以科学事实为依据。不过shameman网友 如果过分轻视原理的重要性,我确实不敢苟同。科学原理(理论)是提炼自科学事实的 一种假说,它的作用在于可以更好地使我们观察、理解科学现象、事实,可以更科学地 横向比较分析不同科学事实之间的内在联系,可以更准确地指导我们未来的科学实践活 动。例如,如果我们不知道实验原理,请问,那我们在想要重复魏的人内皮细胞免疫实 验时应该注意控制哪些实验条件才能真正得出科学的结论。要是稀里哗啦只管弄点人内 皮细胞打进小鼠体内,人家只要一句话就能让你哑了:“实验条件明显不同,结果之间 不具备任何可比性”。但是,如果我们弄清了实验的理论基础,就能基本重复该实验 (涉及细胞和动物的生物学实验不可能象物理学实验那样完全重复,要是生物学实验两 次结果一模一样,那才肯定是造假),而让人无话可说。例如,如果需要我重复魏的人 内皮细胞免疫实验,我不会急于开始的,首先我会根据他的理论(理论分析详见我的以 往的各篇文章,这里不再复述)向他索要以下数据方会开始实验:(1)该WB所用免疫血 清的小鼠所免疫的内皮细胞的具体传代代次?魏文中已经交待了内皮细胞的来源是来自 原代分离的细胞,考虑人脐静脉内皮细胞属于正常内皮细胞,我认为可以忽略来源供体 之间的差别,不需要再询问。同时,魏等在文中交待了采用的是5-12代的人内皮细胞。 但是,目前的研究结果和我的实验室平时在培养多种内皮细胞过程中的经验,培养的内 皮细胞可能在几代之内就发生明显的形态学的改变,这意味着必然有相应的分子表达谱 的改变。所以,更为具体的所使用内皮细胞的传代代次有助于支持结果更具科学性。 (2)内皮细胞在制备疫苗前的增殖状态,具体的控制指标。是采用细胞汇合程度控制? 还是采用检测增殖相关抗原(PCNA、Ki-67等)进行控制?内皮细胞的增殖状态在极大 地程度上决定了它的分子表达谱的变化,从而显著影响实验结果。而人脐静脉内皮细胞 在体外培养中的增殖状态又极大地受培养条件的影响,例如,它受生长因子的类型、活 性、质量、换液周期影响,同时还受细胞分散度、汇合程度的影响(人脐静脉内皮细胞 具有接触抑制的特性,细胞接触后抑制增殖,转向静止状态)。(3)内皮细胞收获的具 体方式和参数?内皮细胞的收获将影响其膜表面分子的分布和数量,到底是直接刮下来 的?还是消化液消化下来的?如果使用消化液,消化时间控制在多少?别看这些具体小 问题,不注意的话有时真能让你对一个不可解释的实验结果找不到北。(4)细胞固定后 完整性检查的具体指标,镜下观察百分之多少的细胞保持完整形态为合格?(5)免疫用 固定细胞的具体数量?呵呵,这个自然不用说了,抗原数量不同,激发的免疫反应的具 体情况自然不同。(6)WB采用的是混合血清还是单只小鼠的免疫血清?免疫系统具有显 著的个体差异,即便是纯系小鼠也不例外,这也是我们平时制备单抗时一免疫就免疫5 只以上的小鼠的原因:尽量避免个体差异,以获得最高抗血清效价的小鼠。(7)免疫后 采血的时间。有了上述的7个参数(剩余的魏文中已经交待清楚,或者我可以自行摸索 调整,例如WB时的抗体浓度啊,显色时间啊),我才会开始我的重复实验,否则,做了 也是白做,试验条件都不一样,拿出来那位专家认这个结果啊。然而,要是你不了解实 验理论原理,你能想得到控制以上的实验参数以科学地得到实验结果吗? 其实我只发表我的理论看法,是因为我不想让我的思维去代替广大网友的思维。大家都 有自己的判断能力,我只把一些科学事实(经过证实的)和一些隐藏在表面现象之下的 科学问题摆出来,这些是不是事实或有没有道理读者可以去查了相关资料后自行判断, 或是来和我辩论。如果这些是事实,那么,广大网友读者心中自然会经过自己的思维形 成自己的判断,我也无意去左右大家的判断。话说回来,现在要是我说我重复了魏等的 实验,获得了相似的结果,有人会信我一个无名之辈的话吗?呵呵,顺便和shameman网 友讨论一些题外话。第一,俺这不算是什么义举,我说过,既然参加了讨论,就要用 心。第二,俺的工作确实最近挺忙,这个俺也不想解释,信不信并不重要。要不是今天 已经是5.1前,恐怕还没时间回复shameman兄。第三,你要是知道我的研究背景就会明 白,我在看法(二)里的发表的都是一些俺耳熟能详的东西,所需做的只是把资料找出 来,再仔细核对一下,看看俺记错了没有。第四,如果仅仅是检索那些文献和阅读,确 实不要花1天的时间,否则科研信息获取能力有待进一步加强。呵呵,承蒙shameman兄 夸奖,不过俺说的都是事实,要是不能在2小时以内完成300多google项的初步处理筛选 工作,获得有用的信息,以便进一步查询,那就还得继续努力啊。 yan网友提到俺忽视了魏先生的实验数据本身的真实性,我可以回答您,呵呵,我正在 查,目前我正在分析魏NM文中报道的那些多肽,那些可是发表了序列的东西啊,实打 实,多肽的相关研究也具有较强的可重复性(化学结构单一物,实验条件极好控制), 我正在采用目前肿瘤免疫领域的已知理论、事实去分析这些肽,尤其是integrin的那两 条(alpha v已经有3-D结构信息,VEGFR2胞外区还没有,不好分析)。目前俺还没有发 现数据在可信范围之外,要是俺有新发现,一定发上来。 说到实验数据本身,我想就此发表一下我对司、魏二位先生之争中许多质疑的看法和态 度。目前司先生已经向中科院正式提交了他关于魏先生学术不端的质疑,那么正式的处 理学术不端的程序应该已经启动。按照中科院的规定以及参照美国等科技发达国家的处 理学术不端的相关规定,俺估计先会责成受指控者所属研究机构先行调查,作出结论并 上报审核,如结果有异议或有人上诉,中科院应该会再组织相应的独立委员会和专家再 次调查,最后作出结论。然而,不管是谁调查,程序的第一步都会是由委员会评价指控 是否有可信度,也就是是否有事实、公认的科学依据的支持,或是确凿的人证,可信度 不足的指控可能会被拒绝受理。在这次事件中,司先生及众多网友已经提出了种种质 疑,但在我看来,这些质疑还缺乏相应事实的支持,或是缺乏所质疑的问题与大量相关 报道明显不符的证据。我在以前的文章中已经做过一些分析,这里不再复述,这些质疑 能否通过专家委员会的审核成为有效的质疑举证从而进入下一步的程序,每位网友设想 一下自己是委员会的一员时,从严肃、科学、公正、负责的角度出发,将会作出什么样 的判断呢?至于这几天新出现的某些质疑要求,明显是因为不从事相关领域研究而缺乏 必要的常识性才会提出来。例如,要求魏先生出示小鼠发票,我想,每位自己研究机构 里设有动物房的研究者都知道,买自己研究机构的动物是内部转帐,上哪儿整个发票出 来啊,只有购买外单位动物时才有发票,而且还经常是记账,年底单位间汇总结算。还 有些网友要多肽合成的发票,可魏的NM文章材料与方法中已经写明,多肽采用PE公司的 合成仪合成,你想他会有发票吗?至多也就是购买相关合成试剂的发票吧。还有关于那 张WB图的,我不知道魏先生那儿是不是拍照存档,可俺2000年左右就在使用扫描仪来保 存WB的结果了,而WB生色底物染色的膜易退色,原始的那张膜要是保存到现在,估计早 就退色光了。另外西湖长网友报道他看见了魏的WB照片中的“亮条”,呵呵,我想西湖 长网友用的是nature原网址提供的那张gif图吧,俺前一阵子早就发现了,将该图 (nm1000_1160_F7.gif)在photoshop里将亮度调到-100,对比度调到+40,西湖长网友 所述的情况清晰可见,而且不止一条亮条,SVEC4-10泳道的从上往下的第2、3条带, HUVEC泳道的30KD条带均有上下两边的异常亮条,尤其以HUVEC泳道的30KD条带的亮条最 为明显。当时我也是以为发现了什么,可仔细一想,不对,Photoshop的各种套索均不 会因自身的套索框留下痕迹,痕迹都是由套索选定的区域内除条带外的浅色背景部分的 亮度不同才能产生差异,留下痕迹。但我将该图放大至像素级,发现第一:所有条带两 侧均为自然过渡,未见套索选取粘贴后的异常亮度区域,但套索选取必须形成闭合选框 才能选取、粘贴,那么,条带两侧的选框痕迹上哪去了呢?第二:SVEC4-10泳道的从上 往下的第2条带上方亮条内(就是所谓的“选框”内部位,即可能是“从别处粘贴过来 的部位”)中部偏左有2个深色背景区域,HUVEC泳道的30KD条带上方亮条内右部有1深 色背景区域,这些深色背景区域除了被那条有1个像素宽度构成的亮条异常中断外,跨 过亮条上下两方的区域均为形状和色深相符的自然过渡,也就是说亮条上下两边的背景 确实是属于同一张照片的同一部位,不是粘贴自别处的,证明该亮条不是套索选定粘贴 留下的什么痕迹。我推测可能是由于照片在压缩处理中留下的什么压缩算法异常区域或 是其它什么原因。我又从魏全文PDF文件(nm1000_1160.pdf)上拷下该WB照片,也放到 Photoshop里,这次未见各条带有亮条,但却发现1、2泳道与3泳道之间有一明显的分割 线,象是两个照片拼在一起的。但是,倒回直接下载的gif格式照片,却未见此分割线 的存在。至此,我判断亮条与分割线都是照片文件在编辑部处理压缩过程中产生的(这 些都是nat med网站提供的文件下载后分析得来的,结果在不同的文件中,却有完全不 同的发现)。因此,直到目前为止,我仍然没有发现这张照片有任何经PHOTOSHOP造假 处理或粘贴的证据。有photoshop软件的网友可以自己去试一下,看看是不是如我所 说。还有,有的网友可能继续出来跟我谈该照片是逐像素点手绘处理的结果,但要是逐 点手绘,干嘛不把亮条抹了,再说逐点手绘后,在技术上是不可能再分辨图片是否是经 过修改的了。还有,关于4万只小鼠的问题,我想说的是,仔细地去读读NM原文,包括 材料与方法,看看哪个地方那句话能证明需要那么多老鼠。否则如果这种质疑也提交专 家委员会的话,恐怕当场就会被打回来。有许多网友提出的质疑,多数是因为缺乏相关 领域的专业知识而显得过于简单,很容易被回答或推翻。例如质疑NM的四种肿瘤生长曲 线基本一致,实际上,这只是因为纵轴采用了肿瘤直径,因此难以看出肿瘤体积的变化 而已,针对那四张图,如果我们取第20天的对照组肿瘤体积大小来做考察,发现图a、 b、c、d的肿瘤直径约为1.7cm、1.8cm、1.3cm、1.4cm,那么按照肿瘤体积计算公式, 这四张图第20天时的肿瘤体积相对值分别为:2.6、2.9、1.1、1.4,最大相差2.6倍, 差别还不够明显吗?少数网友的质疑甚至表现出极不严肃的一面,根本是没有去认真看 一眼那篇NM文章而只是头脑一热张嘴就问的结果,例如有的网友甚至认为魏等是在裸鼠 身上进行疫苗实验。我也曾多次提醒网友仔细阅读文献,多提科学性强、以事实为依据 的质疑,可收效甚微。如果我们以这种仅仅凭借热情的态度去打击学术不端行为,恐怕 也难以收到我们所期望的效果。 我自己对司、魏二位先生之争的态度很明确,我希望四川大学成立一个真正具有学术权 威性的独立委员会(如果川大有困难,可请求中科院和NM编辑部的协助),这个委员会 应该具有以下特征:1.独立,与双方均无利害联系;2.权威,我更希望由国内相关专家 会同国际相关权威专家共同组成。然后,川大委托这个委员会从事听证、评价指控、质 询双方、独立调查、做出结论、撰写并独立发布调查报告的整个过程。如果这样一个委 员会认定需要重复实验,呵呵,到时我倒是非常乐于报名参与重复实验。 说到重复实验,我认为魏等的NM一文虽然内容庞杂,但核心实验只有两个:人内皮细胞 免疫可以抗血管治疗肿瘤;和所筛选获得的异种多肽免疫小鼠具有抗血管治疗肿瘤的作 用,且同时比小鼠序列的相应多肽更易诱发体液免疫反应。有很多网友错误地认为魏等 报道的异种疫苗免疫主要是通过VEGFR2和integrin alpha v在起作用,其实魏等在文章 中从未提到VEGFR2和integrin alpha v在起主要作用,只是根据检测的结果认为这两种 分子至少涉及其中而已。其实,我认为起作用的分子也绝不是WB上的那少数几个条带。 我想,在异种内皮细胞免疫产生的交叉型自身抗体中,应该是构象表位的抗体占了多 数,毕竟分子进化更趋向于维持构象的相似性。然而目前仍然没有好办法去筛选分离这 些构象表位,只能等待进一步的技术的进步了。 最后我想说一点,我以前说过FDA和我国的SFDA在15-20年之内都可能不会批准异种细胞 疫苗产品上市,但是最近我看到一个报道,可能我真的老了,已经变得有些保守了,也 许,我的预言会被俄国人打破。2005年9月在希腊开了个国际癌发生生物学和医学会议 (国际癌发生生物学和医学协会主办的),会上俄罗斯学者报告了他们关于Xenogeneic cells as anticancer vaccine的初步临床试验结果(Cancer Research, Tumor Markers, Clinical Oncology. 33rd Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, ISOBM, Rhodes, September 2005: Abstracts. Tumor Biology 2006, Vol. 27, Suppl. 1. O-80,O-81摘要)。他们首先 在小鼠模型上证明免疫活的人SK-Mel-1黑色素瘤细胞可以保护小鼠在接种小鼠黑色素瘤 B16时抑制肿瘤生长,然后,他们在30个黑色素瘤晚期病人身上接种了小鼠的B16黑色素 瘤细胞进行免疫治疗,开展了异种细胞疫苗治疗黑色素瘤的I/II期临床试验研究,期望 小鼠B16细胞在接种入病人体内生长后可以诱发有利的自身免疫反应,结果在接种免疫 后第14天,观察到病人CD4+T细胞达到活化的高峰,第30天CD8+T细胞达到活化高峰,同 时,在81%的病人中观察到十分有利于肿瘤治疗迟发型超敏反应。我想,我国的科学家 面临两种选择:一种是等待1-2年,等俄国人的I/II期临床试验结果出来了之后再作定 夺;或者,我们从现在开始推进这种疗法的临床前研究,在充分检验其安全性的基础上 (我赞成必须充分检测其安全性,因为主动免疫治疗可不象过继性免疫治疗例如单抗治 疗,在发现难以忍受的毒副作用后可以停药以控制毒副作用,免疫反应一旦激发,可就 只能采用十分不利于病人的非特异抑制免疫系统的方法来控制毒副作用了),积极向临 床试验的方向发展。 呵呵,这一写就写了好几个小时,看来只能等下次我再和各位网友共同探讨一下司魏通 讯文章的第三个问题了。 (XYS20060501) ◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇