◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇ 我对魏NM一文的看法兼与太平闲人探讨 天行健 欣见太平闲人网友就魏于全院士论文事件目前各方观点汇总和评论一文，其中多数分析 均表现出较好的科学素养，但在资料查询方面功夫仍下的不够，并可能是限于专业的差 别，对此领域中许多实际研究情况尚不够了解，另外多学科知识交叉运用稍显薄弱。然 而闲人网友表现出的科学举证之风已大大超过了以往的种种对魏的质疑，幸甚幸甚。我 还是那句老话，多看看文献资料，多潜心思考思考，博采众家之言，科学地形成自己的 判断，不要流于表面，更切莫武断下结论。许多网友在此事件中采用了想当然的思维方 式，生搬硬套，所表现的科学素养实难令人苟同。也可能是事情毕竟不是自己的，懒得 用心去思考吧。然而我认为既然参与发言，就应该尽自己最大努力去做，尽可能地避免 一些较简单的错误提问，贻笑大方于诸多网友前。 太平闲人网友汇总的疑问之多，我难以一一评论，仅就闲人网友对魏文章自己仍觉得尚 存疑问的方面与闲人等广大网友交流一下，其他的既然闲人网友自己尚不觉得存在什么 大问题，我也就略去了。同时我也在此一并发表我对魏NM一文的观点及对魏先生今后研 究方向的一些个人建议。我见过魏先生，但仅仅见过，甚至没有与魏先生说过话，我对 魏先生研究的评述以及建议，先生若尚觉有用可来信与我探讨，我的地址先生可向方舟 子先生索取。其他广大网友如果仔细地阅读过本文后有原则性意见，欢迎拍砖，小处的 意见就免提了吧。并且，我先在此申明完全保留本文中的观点的版权。 太平闲人网友关于魏先生NM一文的疑问： 1.魏免疫方法的理论依据。2.肿瘤生长曲线的不合常理。3.图2与图5e 的矛盾。4. western blotting结果及两个蛋白的相关问题。5.多肽抗原设计合 理性和免疫原性。 太平闲人网友关于魏先生中华肿瘤一文的疑问： 重要的就是问题1：图2肿瘤生长曲线问题。 我关于魏先生NM一文的思考： 首先，我想简介一下我将用到的一些基本概念和基本理论及实验基础。我想先明确一下 抗原抗体反应中的表位的概念。表位是指抗原上特异地与相应抗体的超可变区构成结合 位点相结合的，具有其独特物理化学特征（各种由构型和侧链基团最终决定的多种相互 作用力，目前已发现至少包括氢键、范德华力、疏水作用力、电荷相互作用等）。表位 至少可以被分成两类：连续表位（通常是指由氨基酸序列即一级结构决定的表位，例如 抗体在Western blot中识别的抗原表位，通常不到9个氨基酸残基左右长度的肽就可以 构成一个连续表位），以及非连续表位（例如由蛋白质三级结构决定的表位，我们在冰 冻切片的免疫组化或免疫荧光中可以检测到，而同时采用该抗体不能在WB中检测到的表 位）。总的来说，抗原抗体结合实际上是由特定空间位置上的各相互作用力参数决定 的，例如，它可以是由特定空间位置上呈现特定的侧链基团来决定。实际上，这也就是 采用多肽药物或小分子化学合成药物模拟抗体药物的理论基础。其次，我想介绍一下自 身抗体，尤其是肿瘤相关的自身抗体的产生机制。在过去的20多年中，大量的证据显示 机体对自身肿瘤的成分也能产生体液免疫反应，1995年NM发表了关于P53自身抗体研究 的论文，同年鉴定自身抗原的血清学分析技术被创立，此后就开展了大量的关于肿瘤自 身抗原、抗体的研究。目前，已经鉴定了2000余种可以引起肿瘤病人产生自身抗体的自 身抗原。虽然到目前为止仍未明确机体对自身抗原产生自身抗体的详细机制，但抗原突 变引起自身抗体（例如P53，有报道指出其突变是引起自身抗体的机制之一）不仅符合 免疫学对免疫系统识别“异己”抗原的经典认识，也符合大量的实验现象报道。需要指 出的是，所有的相关实验报道都表明，即便是由于突变的自身抗原引起的肿瘤自身抗 体，同时也可以与野生型抗原反应。这些提示了野生型抗原突变是提高自身抗原免疫原 性、诱导自身抗体产生的机制之一。 好了，下面言归正传。看看我是如何看待魏先生的NM论文的。 1.魏免疫治疗方法的理论依据： 我对魏免疫治疗方法的观点可以用一句话来概括：这是采用天然机体免疫系统对基于分 子进化的内皮细胞蛋白质组近似表位定向突变蛋白库进行筛选，以期获得自身肿瘤血管 内皮细胞异常表达的、可诱导交叉型自身抗体反应的异种抗原及与生物活性中心相关 （在内或在临近位置）的可诱导有效拮抗型自身抗体的异种抗原肽段。 众所周知，肿瘤血管内皮细胞虽然在遗传学上仍然基本保持了正常内皮细胞的遗传稳定 性，但由于受到肿瘤细胞及微环境中其他相关细胞分泌的各种因子的影响，其蛋白表 达，尤其是细胞膜表面的多种具有重要功能的蛋白表达异常（例如生长因子受体、粘附 分子等等，文献太多，这里不再列出）。然而由于内皮细胞蛋白属于自身蛋白，并且随 时随地接触免疫系统，因此在一般情况下难以突破免疫耐受诱导产生其自身抗体。但如 能有效地诱导抗内皮细胞异常表达蛋白的自身抗体反应，则可能因自身抗体与这些重要 功能的蛋白结合而产生种种有利的抗肿瘤生物学效应（可能包括的效应有：封闭多种生 长因子受体；干扰内皮细胞参与的多种粘附作用（粘附对内皮细胞的生长、存活、发挥 功能都很重要）；引起内皮细胞凋亡等等），从而有效地抑制肿瘤新生血管的形成和摧 毁已形成的肿瘤血管，进而达到有效治疗肿瘤的作用。然而，这一策略实际应用时却面 临两大难题：如何有效地诱发异常表达的内皮相关的自身抗原的自身抗体；如何避免同 时诱导产生因能与正常组织交叉反应而产生不可忍受的毒副作用的自身抗体。既然突变 是提高抗原免疫原性的可能机制之一，那么构建具有天然构象的内皮相关突变蛋白库， 并将其免疫小鼠，利用小鼠免疫系统的对天然的正常表达的自身内皮相关抗原免疫耐受 很强的天然筛选机制，成为解决前述两大问题的非常可行的方法之一。然而，如何保证 突变抗原所诱导的抗体仍能与宿主自身抗原发生较强的免疫结合反应，从而有效地发挥 其生物学功能又成为摆在面前的难题之一。构建完全随机突变的蛋白库几乎是不可能 的，本来就已经在蛋白组的水平，还要完全随机突变，至少目前的技术不可能实现这一 点。利用已有蛋白空间结构知识，通过计算机计算模拟，获得可能具有相似构象及空间 理化特征的表位（以保证突变蛋白有很大的可能性与相同抗体结合位点结合）的多位点 突变的突变抗原的信息对单一蛋白来说或许可能，但如放大至多种蛋白质乃至蛋白组的 规模，目前也不可能。目前已经知道，在分子进化中大量蛋白的功能活性中心及临近位 置的一级结构和空间结构是相对保守的，这就意味着，自然界为我们提供了一个能在较 大程度上保证蛋白功能活性中心的各表位在构象及空间理化特征方面保持较大相似性的 蛋白质组级的突变蛋白库——异种细胞。说到这里，我们可以看到，由于人脐静脉内皮 细胞已被证明表达大量在肿瘤血管内皮细胞上也表达的功能性蛋白，因而人脐静脉内皮 异种内皮细胞实际上就是一个天然存在的基于分子进化的内皮细胞蛋白质组近似表位定 向突变蛋白库，一方面，该库中的各功能蛋白确实在一级结构及空间构象上发生了一定 的突变，从而将可能具有更有效诱导宿主抗体反应的能力；另一方面，自然界分子进化 规律又制约了这种突变的范围，使其在各表位尤其是功能活性中心及临近位置的一级结 构、空间构象以及空间理化特征方面表现出远远超过随机突变的相似性，从而在较大程 度上保证了这种突变蛋白诱导的抗体也可与宿主相应的野生型蛋白结合（见前面的抗原 表位的基本概念）。当采用这种基于分子进化的内皮细胞蛋白质组近似表位表位定向突 变蛋白库（例如，人的内皮细胞）免疫小鼠后（当然，这里在免疫上用了一些小技巧， 例如采用了多聚甲醛固定的方法保持细胞的大体形态、部分空间构象，还可能增强了其 免疫原性），魏等采用小鼠的保护性免疫实验、治疗性免疫实验和过继性免疫治疗实验 等实验证明，这个异种细胞构成突变蛋白库的免疫促使宿主小鼠打破了一些肿瘤内皮细 胞相关功能性蛋白原本在其免疫系统中处于一定程度的免疫耐受的状态，产生了足以有 效抑制肿瘤内皮细胞增殖（其他方面的功能未见相关实验设计）的相应自身抗体，并能 有效地通过抗血管的机制治疗肿瘤，获得了预期的结果。另一方面，通过免疫组化和正 常组织病理检查等实验证明，在所诱导的自身抗体（不是免疫所诱导的所有抗体）中， 至少是较特异地与肿瘤血管内皮细胞反应的自身抗体占了优势，因而还是可以有效控制 这种自身免疫反应（可产生广范正常组织交叉反应的表位更难以被打破免疫耐受状态， 这就是小鼠免疫系统的天然筛选机制）不产生明显的毒副作用。最后，由于预期的结果 已经获得，支持了以上的理论设想，实验结果表明了多种异种抗原诱导的自身抗体在一 起时可以非常有效地抗肿瘤血管治疗肿瘤，然而，最核心的部分之一，也是决定今后研 究工作走向的关键之一，所有的理论设想都是基于突变的异种抗原近似表位可以更容易 地诱发具有抗肿瘤血管生成的生物学功能的自身抗体这一基本假设，那么，实际情况是 这样的吗？所以魏等采用WB获得了一些可诱导自身抗体的异种抗原的分子量信息，并采 用ELISA结合实验证实其中至少包含了VEGFR2和Integrin alpha v。基于最大程度表位 相似的挑选原则，魏等放弃了对整个近似表位肽段的筛选（其实当时谁也没那么多钱去 做非常大量的肽段），而仅仅是将兴趣放在了表位近似程度最高的最大同源度肽段上， 甚至不惜合成了42对肽来证实此事（有的网友不理解此事，认为这与论文的关系不大， 其实这正是本篇论文的精华所在，由此才能初步明确异种免疫的机制，从而指导以后的 研究工作），虽然魏等仅将注意力集中到了最近似的表位方面，放弃了其他的一些可 能，但幸运的是，魏等鉴定到了3个这样的异种肽段，为异种免疫理论提供了强有力的 支持。这3个肽段与宿主序列比较都发生了突变，但在相同的免疫条件下，这3个异种肽 段比宿主肽段更容易诱导机体产生抗体反应，并且诱导的抗体可与宿主肽段结合，属于 自身抗体，同时还能抑制肿瘤的生长。经分析，这3个肽其中1个位于VEGFR2活性中心 中，2个位于Integrin alpha v活性中心临近位置（对于IgG抗体这种150KDa左右的大分 子来说，与活性中心结合或与其临近位置结合均可能发挥相似的阻断抗原与配体结合的 功能），也从理论上提示了它们的抗体可能发挥抗肿瘤活性的结果。至此，异种免疫的 理论及其基本假设均获得了实验支持，然而，异种细胞毕竟是一个难以全部确定其蛋白 表达谱的蛋白质组级的混合物，难以进行进一步的研究；异种内皮细胞虽与宿主肿瘤内 皮细胞蛋白表达谱交叉，但交叉程度未知；如果诱导强烈的异种免疫后，在提高疗效的 同时，是否会带来难以忍受的毒副作用也是未知的。所以魏等在发现了实际上是表位近 似的异种突变抗原表位在起作用后，就直接采用了已经证实的肿瘤血管内皮相关功能性 蛋白开展异种蛋白分子的抗肿瘤作用的研究去了（后来他报道了chicken homologous Tie-2、Xenopus laevis vascular endothelial growth factor (VEGF)、porcine endoglin、chicken MMP-2、Xenopus FGFR-1、chicken homologous integrin beta3， 还有2个肿瘤相关的truncated mouse EGFR、xenogeneic (human) EGFr）。以下是我与 魏先生讨论的内容，我认为如果研究已经确定在了特定的异种功能性分子上了，若先研 究清楚哪些同源肽段可能诱发自身抗体并发挥抗肿瘤功能，就可以在此基础上采用生物 信息学计算的方式人工进行“分子进化”以进一步提高其效果，并可能减少与其它类似 的正常组织表位的交叉反应以降低毒性（这一点不知是否也可通过计算初步筛选），而 不必在全分子水平上进行其它不同进化水平的异种分子的筛选（这样选择性较小，毕竟 许多异种分子尚未报道序列结构），国内生物物理所及北大化学系都从事这种结构分析 的相关工作，可考虑合作。另外，我比较赞成肽段性质的疫苗，毕竟其与正常组织的交 叉反应更容易观察分析，也更容易改构以控制其毒副作用，安全性更高，在现在的条件 下更容易上临床。 2.肿瘤生长曲线的不合常理： 已经有网友提到过了，动物实验可变因素太多，不可能完全重复，通常只要求重复实验 反映了相近的治疗结果既可。单纯在纸上讨论，100年也讨论不出一个结果，所有的细 节参数都没有，包括动物体重、体重生长速度、接种细胞具体数量、接种前细胞活度、 接种后细胞活度、接种具体部位，进针的深浅等等。 3.图2与图5e的矛盾： 首先明确一个概念，肿瘤是否受到抑制，是否缩小，并不完全依赖于血管密度。实际上 肿瘤的养分氧气供应最直接地是受有效血流灌注量的影响，一方面是受血液灌注量（灌 注量很大程度上受血管密度影响）的影响，一方面受灌注的血液与肿瘤细胞之间的交换 效率（例如血管通透性等）的影响。目前尚无任何证据表明肿瘤生长仅仅并且只能受血 管密度的影响，理论分析也不支持这一说法。同时，肿瘤生长过程中，尤其是严重血管 生成依赖的实验动物肿瘤中，肿瘤的血供一直处于一种将够未够的低限状态，对血管的 较显著的影响就足以产生非常显著的肿瘤生长的差异。因此不能作出肿瘤开始抑制就必 须同时伴随肿瘤血管密度显著降低的结论。在抑制肿瘤血管生成的同时动态监测肿瘤血 管密度的论文较少，找到了几篇可能有记录的，但都不免费，由于我尚未见到关于这方 面其他家的详细报道，自己也没有做过类似动态观察，也无法作出最终结论。 4.western blotting结果及两个蛋白的相关问题： western blotting结果本应该采用质谱分析的方法确定条带代表的蛋白，但魏直接以公 开信息加上推测，并最终采用ELISA验证的方式直接绕过。虽然不能证明那两条带是否 完全由VEGFR2和Integrin组成，但魏等在文中采用重组蛋白的ELISA和合成肽段的ELISA 证明了至少包含VEGFR2和Integrin。至于有的网友非要往不连续表位上套的说法，显然 没有考虑WB阳性就意味着存在连续表位的可能。 5.多肽抗原设计合理性和免疫原性： 关于多肽抗原的设计原理，我在上文中已提及。这是一种较为实际的做法，虽然可能漏 掉代表许多有用的表位的多肽。突变抗原产生免疫原性本身不足为奇，不突变的自身抗 原都可以免疫出较高滴度的抗体（已经有网友也提及了这个现象，我自己在实验中也曾 采用小鼠完全同源的结构型蛋白的肽段制备鼠单抗），诱导产生抗体反应的规律目前仍 然没有弄清楚，单纯从结构变异程度来推想无异纸上谈兵。其实多肽序列已经给出，将 其免疫小鼠就立即可以知道结果了。至于为什么“比较复杂的蛋白分子结构知识的问题 却别魏用线性方法轻易解决”，详见我在前面1中的所述。另外，免疫血清中的抗不连 续表位的自身抗体并没有证据表明其不存在，但实际情况中想在较大规模水平上开展鉴 定工作太难了，那位网友可以举出大规模鉴定不连续表位的技术？ 关于魏先生中华肿瘤一文： 1.图2肿瘤生长曲线问题。 我在以前的文章中已经提出过解释，但是诸位不信。这里不再复述，只给出C57小鼠照 片一张，同时奉劝一些网友，不要只让你的技术员去动物房，自己也多去去。现在要动 物操作上岗证了，可能有的网友就不具备资格进入动物房了，但我的已经换证一次了， 这几年都合法有效。 以上是我的一些个人观点，欢迎广大网友讨论，我个人尤其欢迎太平网友与我讨论。 (XYS20060410) ◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇